Хроматографические методы исследования фитопрепаратов из некоторых видов растений

Метод хроматографии был открыт в 1903г. русским ботаником М.С. Цветом, который впервые этим методом разделил хлорофилл растений на ряд веществ. В основе хроматографического анализа лежат сорбционные  процессы, распределение вещества между двумя фазами и явления осаждения. Известно много видов хроматографии: бумажная, тонкослойная, колоночная, газо-жидкостная и др. На практике с помощью данных методов анализируют смеси веществ, состоящие из разных компонентов. К таким смесям относятся почти все природные объекты – руды, минеральные воды, лекарственные средства животного и растительного происхождения.

Цель исследования — исследовать 30% водно-спиртовые фитопрепараты, полученные из некоторых видов растений (элеутерококк, медвежий корень) различными хроматографическими методами (жидкостная колоночная и тонкослойная хроматография) и изучить их состав с помощью фитохимических реакций.

Материалы и методы исследования:

Фитопрепараты полученные из травы элеутерококка и медвежьего корня. Комплекс физико-химических методов: фитохимические реакции, хроматографические методы.

Экспериментальная часть

  1. Тонкослойная хроматография.

Разделение проводили на хроматографических пластинах «Сорбифилл». Растворитель: бутанол-уксусная кислота-вода в соотношении 6:2:1. На стартовую линию (3см от края пластины) с помощью капилляра наносили 5 капель исследуемого образца. Затем пластину подсушивали и помещали в хроматографическую камеру на 40 минут. После окончания хроматографирования пластину извлекали из камеры и обрабатывали различными проявителями.

Образец фитопрепарата травы элеутерококка в результате хроматографирования был разделён на 4-е пятна, образец фитопрепарата медвежьего корня – на 5 пятен.

Проявители:

А) 20% раствор H2SO4.Сапонины дают в УФ-свете пятна вишнёвого цвета.

Б) 1% раствор ванилина в концентрированной HCL. Дубильные вещества дают в УФ-свете красно-оранжевые пятна.

В) Реактив Драгендорфа. Кумарины проявляются в виде коричневых пятен.

Г) 1% раствор аммония хлорида. Флавоноиды образуют ярко флуоресцирующие пятна жёлто-зелёного цвета.

Д) 5% раствор NaOH в этаноле. Антраценпроизводные в УФ-свете образуют пятна розового цвета.

Методом тонкослойной хроматографии нами были обнаружены в образце фитопрепарата травы элеутерококка сапонины, дубильные вещества, кумарины и флавоноиды. В образце медвежьего корня — сапонины, дубильные вещества, кумарины, флавоноиды и антраценпроизводные.

  1. Жидкостная колоночная хроматография.

Хроматографирование проводили в режиме гельпроникающей хроматографии на стеклянной хроматографической колонке. В качестве адсорбента применяли 5мл геля Сефадекс LH-20. Сверху на слой адсорбента наносили 0,5 мл исследуемого фитопрепарата. Элюция: вода дистиллированная (5мл), спирт этиловый (1:1 – 5мл) и отмывка 0,01н  NaOH, 0, 1н  NaOH. В результате было получено 26 фракций. Объём одной фракции – 1мл. Скорость элюции – 25-35 капель в минуту. Окрашивание фракций:

  1. Фитохимические реакции.

С помощью фитохимических реакций сначала нами были исследованы фитопрепараты (см. табл №1,2), а затем полученные фракции.

 

Таблица №1    Реакции на дубильные вещества

п/п

Название образца ацетат свинца, уксусная кислота антипирин 1% раствор желатина 1% раствор ванилина
1 Настойка травы элеутерококка Осадок бежевого цвета Осадок светло-коричневого цвета  

Мутный осадок

 

Осадок белого цвета

 

2 Настойка медвежьего корня Осадок бежевого цвета Осадок светло-коричневого цвета  

Мутный осадок

 

Осадок белого цвета

 

 

Таблица №2    Реакции на сапонины, флавоноиды.

п/п

Название образца На сапонины с

ацетатом свинца

На флавоноиды с берлинской лазурью
1 Настойка травы элеутерококка Осадок коричневого цвета  

Бурый осадок

2 Настойка медвежьего корня Осадок коричневого цвета  

Бурый осадок

 

Полученные фракции дали реакции на дубильные вещества, сапонины, флавоноиды.

  1. Фитопрепарат из травы элеутерококка

А) На сапонины:

Фракция №2 – осадок светло-коричневого цвета;

Фракция №3 – осадок коричневого цвета;

Фракция №4– осадок жёлто-оранжевого цвета;

Фракция №5 – осадок коричневого цвета на стенках пробирки;

Фракция №10 – раствор окрашен в бледно-коричневый цвет;

Фракция №22 – осадок в виде хлопьев белого цвета:

Фракция №23 – осадок жёлто-коричневого цвета;

Фракция №25 – бледное жёлто-оранжевое окрашивание раствора;

Фракция №26 – осадок в виде хлопьев белого цвета.

Б) На флавоноиды:

Фракция №17 – осадок бурого цвета на стенках пробирки;

Фракция №26 – осадок бурого цвета.

В) На дубильные вещества:

— ацетат свинца + уксусная кислота

Фракция №2 – осадок тёмно-коричневого цвета;

Фракция №3 – осадок тёмно-коричневого цвета;

Фракция №4 – осадок светло-коричневого цвета;

Фракция №5 – осадок коричневого цвета;

Фракция №6 – осадок коричневого цвета;

Фракция №23 – осадок коричневого цвета.

— антипирин

Фракция №2 – осадок коричневого цвета;

Фракция №3– осадок белого цвета;

Фракция №4 – осадок коричневого цвета.

 

  1. Фитопрепарат из медвежьего корня

А) На сапонины:

Фракция №3 – осадок светло-коричневого цвета;

Фракция №4– осадок жёлто-коричневого цвета;

Фракция №5 – осадок коричневого цвета;

Фракция №9 – осадок тёмно-коричневого цвета:

Фракция №21 – осадок жёлто-коричневого цвета;

Б) На флавоноиды:

Фракция №19 – осадок бурого цвета на стенках пробирки;

Фракция №25 – осадок бурого цвета.

В) На дубильные вещества:

— ацетат свинца + уксусная кислота

Фракция №2 – осадок тёмно-коричневого цвета;

Фракция №3 – осадок тёмно-коричневого цвета;

Фракция №4 – осадок светло-коричневого цвета;

Фракция №5 – осадок тёмно-коричневого цвета;

Фракция №6 – осадок тёмно-коричневого цвета;

Фракция №18 – осадок коричневого цвета;

Фракция №20 – осадок коричневого цвета;

Фракция №23 – осадок коричневого цвета.

— антипирин

Фракция №2 – осадок коричневого цвета;

Фракция №3– осадок белого цвета;

Фракция №4 – осадок коричневого цвета.

Фракция №5 – осадок светло-коричневого цвета;

Фракция №6 – осадок светло-коричневого цвета;

Фракция №18 – осадок светло-коричневого цвета;

Фракция №20 – осадок коричневого цвета;

Фракция №23 – осадок коричневого цвета.

 

  1. Количественное определение.

Определяли дубильные вещества, так как по результатам фитохимических реакций можно предположить наибольшее их содержание в фитопрепаратах, по сравнению с другими выделенными нами биологически активными веществами.

Применяли метод перманганатометрии (ГФ. ХI).

Методика: к 5мл 30% водно-спиртового извлечения прибавляли 5мл воды и 25 мл индигосульфокислоты. Титровали рабочим раствором 0,02моль/л KMnO4 до золотисто-желтого окрашивания раствора.

В качестве контрольного образца использовали 1% раствор танина.

На титрование раствора танина пошло 10,5мл рабочего раствора 0,02моль/л KMnO4. На титрование водно-спиртового извлечения из медвежьего корня —    мл рабочего раствора 0,02моль/л KMnO4.

Расчёты:

К проблеме стандартизации качества некоторых фитопрепаратов из различных видов копеечника (Hedysarum; сем. Fabaceae).

Известно, что сегодня в России лекарственное растительное сырье, содержащее ксантоны и их аналоги, представлено только травой копеечников альпийского (H. alpinum L.) и желтеющего (H. flavescens Regel et Schmalh ) [ 1, учеб. пособ. Фармакогнозия, СПБ-2006]

Ключевым биологически активным веществом (БАВ) этих объектов является С-гликозид мангиферин (рис.), выделенный В.И. Глызиным и сотрудниками еще в 70-80г.г. прошлого века [2, обзор 2004г.].

Результаты и их обсуждение

Как показано в недавних наших работах [5, ГуровЕ.А. Вестник РАЕН.- 2007;7, В.В.Халахин, Ползуновский вестник.-2008] ППГ оказались весьма удобными хроматографическими носителями для методов ГПХ ряда природных соединений (гуминовые и гуминоподобные кислоты, флавоноиды и др.). ППГ типа сф. CL-4В, по данным [5, Гуров, 2007], имеют повышенную липофильность, отчетливую «ячеистость» полимерного каркаса, устойчивы в широком диапазоне рН среды (от рН 1 до рН 12). Они легко химически модифицируются (эпоксиактивация и др. способы), поэтому широко применяются  как носители в различных вариантах аффинной хроматографии (АФХ): классическая АФХ [8, энцикл.]; неклассическая АФХ [9, Кузнецов П.В. Кузбасс ВУЗ издат.-2002г. Таким образом, по нашему мнению, ППГ, наряду со знаменитым липофильным сефадексом LH-20, [5,9] исключительно актуальны для разделения, выделения, накопления (полумикропрепаративного) и отчистки многих видов растительных БАВ  в химии природных соединений (фитохимии).

Полученные экспериментальные данные по общему фитохимическому скринингу исследуемых ФП №1-№4 представлены в таблице 1.